Purificación de la enzima homoserina deshidrogenasa de Malassezia furfur y detección de treonina como inhibidor competitivo a partir de la actividad enzimática y los parámetros cinéticos de la enzima

Abstract

Las especies de Malassezia son levaduras dependientes de los lípidos y lipofílicas pertenecientes a la microbiota de la piel de los humanos y animales, comúnmente asociadas con enfermedades dermatológicas crónicas. La enzima homoserina deshidrogenasa (HSD) juega un papel importante en el metabolismo de Malassezia furfur, y estudios previos la han reportado como blanco para impedir el crecimiento de este género, así mismo, se ha visto que la treonina tiene una capacidad inhibidora sobre esta enzima. De esta forma, en este estudio se evaluó la actividad enzimática de la HSD frente al aminoácido treonina y se determinó que tipo de inhibidor era. La purificación se realizó mediante la técnica de Dynabeads, a partir de una cepa de Escherichia coli con el clon especifico de HSD, y la medición enzimática se realizó con un kit especifico de cuantificación de NADH, usando varias concentraciones de sustrato y con la presencia del inhibidor. La actividad enzimática fue medida con éxito demostrando la presencia de la HSD en las muestras purificadas, además, se lograron calcular los parámetros cinéticos para una cinética enzimática de Michaelis Menten, con la ausencia y presencia del inhibidor los cuales arrojaron resultados de Vmax de 0.0116 mM/min y Km de 29.72 mM, y Vmax de 0.0137 mM/min y Km de 38.93 mM, respectivamente. Lo anterior, permitió concluir que la treonina actúa como un inhibidor competitivo para el sustrato usado, etanol, por el efecto creciente que tiene sobre el parámetro Km

"Malassezia species are lipid-dependent and lipophilic yeasts belonging to the skin microbiota of humans and animals, commonly associated with chronic dermatological diseases. Homoserine dehydrogenase (HSD) plays an important role in the metabolism of Malassezia furfur, and previous studies have reported targeting to prevent the growth of this microorganism, also, it has been that threonine has inhibitory capacity on this enzyme . In this way, in this study the enzymatic activity of the HSD against the threonine amino acid was evaluated and the type of inhibitor was determined. Purification was performed by the technique of Dynabeads, from a strain of Escherichia coli with the specific clone HSD, and enzyme measurement was performed with a specific quantitation kit NADH, using various substrate concentrations and the presence of inhibitor. Enzymatic activity was measured successfully demonstrating the presence of the HSD in the purified samples also were able to estimate the kinetic parameters for an enzymatic Michaelis Menten, in the absence and presence of inhibitor which gave results Vmax 0.0116 mM / min and Km of 29.72 mM, and Vmax of 0.0137 mM / min and Km of 38.93 mM, respectively. This allowed us to conclude that threonine acts as a competitive inhibitor for the substrate used, ethanol, due to the increasing effect it has on the Km parameter."--Tomado del Formato de Documento de Grado