Staining and extraction protocol for lipid droplets in malassezia globosa and analysis of consumed and secreted lipids during the growth phase

Abstract

Malassezia es un género de levaduras lipido-dependientes presentes en la microbiota de la piel de humanos y animales, asociadas con diferentes trastornos cutáneos. A pesar de la alta prevalencia de estas enfermedades, aun queda mucho por descubrir sobre sus procesos fisiopatológicos. Dentro de su metabolismo lipídico, recientemente se reportó la presencia de lipid droplets (LD). Teniendo en cuenta la dependencia lipidca de Malassezia, se ha dirigido un interés particular al estudio de LD. En este proyecto se realizó la estandarización de un protocolo de doble tinción para identificar LD, un protocolo de extracción de LD, la dinámica de LD en M. globosa y el análisis de lípidos consumidos y secretados de la levadura. Para lograr estos objetivos, se utilizaron tres fluoróforos diferentes para la tinción de LD. Posteriormente, se exploró la dinámica de LD. Se encontró que los LD comienzan a formarse durante la fase de crecimiento exponencial. Además, los números de LD por célula disminuyen cuando entra a la fase estacionaria. También se observó un aumento en la proporción de LD frente al área de la levadura en el tiempo. Con base en estas observaciones, se propone que los LD se aglomeran en el crecimiento de M. globosa. Por otro lado, el protocolo de extracción de LD se implementó debidamente en M. globosa, pero aún se requieren pasos adicionales de purificación. Para estudiar los patrones de secreción/consumo, se estudió mDixon fresco y sobrenadante de mDixon de la levadura cultivada. La extracción de lípidos se realizó mediante un método de Bligh y Dyer modificado y SPE. El análisis lipidómico se realizó mediante HPLC-ESI-QTOF en modo de ionización positivo. El análisis mostró la presencia de diferentes fosfolípidos, cardolipinas, ácidos biliares y ceramidas. En general, hubo un mayor porcentaje de lípidos consumidos por M. globosa en comparación con los lípidos secretados. Se necesitan más análisis para confirmar la identidad de cada lípido individual

Malassezia are lipid-dependent yeast found in the microbiota of humans and animals skin associated with different common skin disorders as seborrheic dermatitis. Despite the high prevanlence of this diseases, much remains to be discovered about the pathophysiological processes triggering its pathogenicity. Within the lipid metabolism of Malassezia, the presence of lipid droplets (LDs) has recently been reported. Considering Malassezia dependency on lipids, particular interest has been directed to the study of LDs. In this project, the standardization of a double staining protocol to identify LDs, a LD extraction protocol, the dynamics of LDs in M. globosa, and consumed and secreted lipids analysis of the yeast were performed. To achieve these goals, three different fluorophores for LD staining were used with Calcofluor White for cell wall staining. Afterward, LD dynamic was explored. It was found that LDs starts forming in M. globosa during the exponential phase growth. Also, LDs numbers per cell decrease when entering to stationary phase. Thus, the proportion between LDs vs. cell area varied more when reaching to late stationary phase. Based on these observations, it is proposed that LDs coalescence while yeast enters to different growth phases. In other hand, LDs extraction protocol was adequately implemented in M. globosa, however, further purification procedures are needed. To study de secretion/consumption patterns fresh mDixon as control and mDixon supernatant of the yeast cultured were studied. Lipid extraction was performed by a modified Bligh and Dyer method followed by SPE. Lipidomic analysis was conducted by HPLC-ESI-QTOF in positive ionization mode. The analysis mainly showed the presence of different phospholipids, cardolipines, bile acids and ceramides. In general, there was a higher percentage of lipids consumed by M. globosa in comparison to the secreted lipids. Further analysis is needed to confirm the identity of each individual lipid